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    液相色谱仪注意事项

    液相色谱是一类分离与分析技术,其特点是以液体作为流动相,固定相可以有多种形式,如纸、薄板和填充床等。在色谱技术发展的过程中.为了区分各种方法,根据固定相的形式产生了各自的命名,如,纸色谱、薄层色谱和柱液相色谱。 
    对液相色谱仪的要求 
    1.流动相必须用HPLC级的试剂,使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45μm或更细的膜过滤)。  
    2.流动相过滤后要用超声波脱气,脱气后应该恢复到室温后使用。
    3.不能用纯乙腈作为流动相,这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
    4.使用缓冲溶液时,做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时,然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上,以充分洗去离子。对于柱塞杆外部,做完样品后也必须用去离子水冲洗20mL以上。
    5.长时间不用仪器,应该将柱子取下用堵头封好保存,注意不能用纯水保存柱子,而应该用有机相(如,甲醇等),因为,纯水易长霉。
    6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
    7.C18柱绝对不能进蛋白样品,血样、生物样品。
    8.堵塞导致压力太大,按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗,清洗方法: 
    ①以异丙醇作溶剂冲洗; 
    ②放在异丙醇中间用超声波清洗; 
    ③用10%稀硝酸清洗;
    9.气泡会致使压力不稳,重现性差,所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
    10.如果进液管内不进液体时,要使用注射器吸液:通常在输液前要进行流动相的清洗。
    11.要注意柱子的pH值范围,不得注射强酸强碱的样品,特别是碱性样品。
    12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗,然后插入新的
    流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 
    常见故障断定及解决方法 
    (一)保留时间变化  
    1.柱温变化:柱恒温,必要时需配置恒温箱
    2.等度与梯度间未能充分平衡:至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
    3.缓冲液容量不够:用》25mmol/L的缓冲液
    4.柱污染:每天冲洗柱
    5.柱内条件变化:稳定进样条件,调节流动相
    6.柱快达到寿命:采用保护柱 
    (二)保留时间缩短 
    1.流速增加:检查泵,重新设定流速
    2.样品超载:降低样品量
    3.键合相流失:流动相pH值保持在3~7.5检查柱的方向
    4.流动相组成变化:防止流动相蒸发或沉淀
    5.温度增加:柱恒温 
    (三)保留时间延长 
    1.流速下降:管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
    2.硅胶柱上活性点变化:用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱  
    (四) 出现肩峰或分* 
    1.样品体积过大:用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
    2.样品溶剂过强:采用较弱的样品溶剂
    3.柱塌陷或形成短路通道:更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
    4.柱内烧结不锈钢失效:更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
    5.进样器损坏:更换进样器转子 
    (五)鬼峰
    1.进样阀残余峰:每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
    2.样品中未知物:处理样品
    3.柱未平衡:重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
    4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) :每天新配,用抗氧化剂
    5.水污染(反相) :通过变化平衡时间检查水质量,用HPLC级的水 
    (六) 基线噪声 
    1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气:加柱后背压
    2.污染(随机噪声) :清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
    3.检测器灯连续噪声:更换氘灯
    4.电干扰(偶然噪声) :采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
    5.检测器中有气泡:流动相脱气,加柱后背压 
    (七)峰拖尾 
    1.柱超载:降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
    2.峰干扰:清洁样品,调整流动相
    3.硅羟基作用:加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
    4.死体积或柱外体积过大:
    连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
    5.柱效下降:
    用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 
    (八)峰展宽 
    1.进样体积过大:同(四)1
    2.在进样阀中造成峰扩展L进样前后排出气泡以降低扩散
    3.数据系统采样速率太慢:设定速率应是每峰大于10点
    4.检测器时间常数过大:设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
    5.流动相粘度过高:增加柱温,采用低粘度流动相
    6.检测池体积过大:用小体积池,卸下热交换器
    7.保留时间过长:等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
    8.柱外体积过大:将连接管径和连接管长度降至最小
    9.样品过载:进小浓度小体积样品

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